熒光定量PCR測定水楊酸鈉作用后大鼠耳蝸基因的表達

1、資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物的選擇及處理 成年健康正常Wistar大鼠(湖北省預防科學院動物實驗中心)30只，體重180～200g，雌雄不拘，耳郭反射陽性，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。適應性飼養7d后，分為兩組：實驗組15只，200mg•kg-1乙酰水楊酸鈉肌注，2次/d，其間間隔8h，連續注射14d，在第15d迅速斷頭取耳蝸;對照組15只,每天等量生理鹽水肌注,與實驗組同時剝取耳蝸。

1.1.2 要試劑和儀器 RIZOL(LifeTechnology公司,美國)、MMLV逆轉錄酶(LifeTechnology公司,美國),PCR試劑(TaKaRa公司,日本),SYBRGREENI染料(MolecularProbes公司,美國),RotorGene3000熒光定量PCR儀(CorbettResearch公司,澳大利亞)。

1.2 方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成 將正常組和水楊酸鈉作用組的大鼠，分別剝離耳蝸，再在顯微鏡下去掉骨質外殼，將其內容物勻漿，然后用TRIzol法(LifeTechnologies公司)抽提總RNA。取1μg的總RNA,用MMLV逆轉錄酶,按照其說明書進行cDNA的合成,-20℃保存。

1.2.2 引物大鼠基因 HSP27引物，上游引物:5′CAAGGAAGGCGTGGTGGAGA3′;下游引物:5′TGGTGACGGCTACTGGGGAT3′，產物長度311bp。大鼠βactin引物，上游引物:5′TTGTAACCAACTGGGACGA;ATGG3′;下游引物:5′GATCTTGATCTTCATGGTGCT;AGG3′產物長度:764bp。

1.2.3 實時定量PCRSYBRGREENI(MolecularProbes)原液存儲 在二甲基硫氧化物中,初始濃度為10000倍,將其稀釋為50倍作為工作液,分裝后,-20℃避光保存。

1.2.3.1 大鼠βactin的PCR反應 引物0.5μmol•L-1,dNTP0.2mmol•L-1,MgCl23mmol•L-1,Taq酶1U,SYBRGREENI0.5倍，1×PCRbuffer,總體積為25μL，循環：94℃變性3min,開始循環：94℃30s,56℃30s,72℃50s,72℃5s檢測熒光，共40個循環。

1.2.3.2 大鼠HSP27的PCR反應 引物0.5μmol•L-1,dNTP0.2mmol•L-1,MgCl23mmol•L-1,Taq酶1U,SYBRGREENI0.5倍，1×PCRbuffer,總體積為25μL，循環：94℃變性3min,開始循環：94℃30s,55℃30s,72℃40s,72℃5s檢測熒光，共40個循環。

1.2.4 基因表達的定量分析 采用Livak等設計的比較閾值法來測定目的基因的相對表達，目的基因的量=2^^Ct，在該公式中Ct是熱循環儀檢測到反應體系中熒光信號的強度值，ΔΔCt=(Ct,目的基因Ct,管家基因)實驗組(Ct,目的基因Ct,管家基因)對照，所以，2^^Ct表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數，使用這一方法可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量。

1.3 數據收集及統計學處理 數據收集主要由RotorGene3000自帶軟件完成。通過軟件計算出所有樣本，包括目的基因和管家基因的起始循環數(Ct),用公式法計算目的基因的量。采用SPSS11.0軟件進行統計學處理，P<0.05為差異有統計學意義。

2、結果

大鼠耳蝸目的基因HSP27和內參基因βactin擴增完成后，以1.5%瓊酯糖凝膠電泳進行產物鑒定(圖1、2);水楊酸鈉作用組和正常對照組的HSP27基因和βactin在各自的反應條件下進行熒光定量PCR測定，反應結束后,通過電腦分析,直接得出定量結果;慢性水楊酸鈉作用組內參基因βactin和目的基因HSP27的起始循環數(圖3、4);實驗組和對照組中目的基因和管家基因的起始循環數及其計算結果，并經t檢驗，P<0.01，兩組對照其差異有統計學意義。由表1可知慢性水楊酸鈉注射后(實驗組)大鼠耳蝸中HSP27的基因表達增強,是對照組的3.16倍。

3、討論

HSP27是HSP家族中小分子量熱休克蛋白(sHSP)亞家族中的一員,分子量為27KD[2]，分為構成型和誘導型。以往的研究已經表明，HSP27家族除了參與調節細胞的生長、分化及作為分子伴侶保護細胞功能之外，還參與微絲的穩定與細胞信號轉導，防止應激后肌動蛋白(actin)微絲碎裂,調節Factin多聚化,影響細胞骨架及細胞遷移等。

Leonova等[4]報告，HSP27在正常大鼠耳蝸內主要存在于外毛細胞的側壁、頂部、Reissner′s細胞膜等，在我們前期的研究中也得出了相同的結果[5]。外毛細胞是聽覺過程中機械-電能轉換的部位，其外側壁由三部分組成，最外層為細胞質膜層(protoplasmicmembrane，PM)，中間為富含肌動蛋白的細胞骨架網(cytoskeleton，CL)，最內層為細胞表面下池(subsurfacecisternae，SSC)。正常耳蝸功能的維持與外毛細胞尤其是外側壁結構的完整性密切相關，因此，Leonova等推測HSP27在正常大鼠耳蝸中持續表達，其作用可能是維持和穩定外毛細胞肌動蛋白細胞骨架，從而對抗外毛細胞在正常聽覺過程中所受到的機械應力。

HSP27基因在啟動子區有熱休克調節元件(HeatShockRegulatoryElement,HSE)及應激相關調節元件(StressrelatedRegulatoryElement,STRE)，其表達受熱休克轉錄因子1(HeatShockTranscriptionFact1,HSF1)的調控。HSF1在大鼠耳蝸內的分布與HSP27的表達部位一致，但位于細胞核內。在非應激狀態細胞內HSF1以非活性的單體形式存在，非活性HSF1經三聚化和絲氨酸磷酸化在應激條件下(如耳毒性藥物，噪聲損傷等)激活，活化的HSF1與HSP27基因中應激相關調節元件結合，從而激活HSP27基因,使其增加。Kazuma等[6]研究發現，HSF1基因敲除鼠雖然聽力正常，但在應激條件下熱休克蛋白的表達不再增加。

關于水楊酸鈉耳毒性作用，Cazals等[7]通過對聽覺電生理的研究發現，水楊酸鈉能引起可逆性的耳蝸復合動作電位閾值升高及耳聲發射幅值下降或升高，提示水楊酸鹽耳毒性的主要作用部位在耳蝸、特別是外毛細;形態學方面，羅燕云等[8]指出，慢性水楊酸鈉注射2周豚鼠耳蝸外毛細胞出現了SSC擴張性空泡形成，同時外毛細胞靜纖毛柔軟、彎曲，表皮板局部溶解。Allen等[9]報告，離體外毛細胞在不同濃度的水楊酸鈉溶液中其外側壁的硬度顯著降低，認為這與水楊酸鈉對外側壁質膜層和細胞表面下池的直接損傷相關。外毛細胞及靜纖毛順應性的改變導致靜纖毛與蓋膜失耦合，引起膜離子通道異常開放，一方面可能導致靜纖毛異常擺動的機械能轉換成電能而傳入，另一方面可能通過蓋膜與內毛細胞較長靜纖毛的緊密接觸而影響到內毛細胞，使內毛細胞興奮性增強，異常電信號傳入。在缺乏外界聲刺激時，異常電信號傳入引起聽覺通路上自發活動增強[11]，引起耳鳴。

在本實驗中，我們比較了慢性水楊酸鈉作用后與正常對照組之間耳蝸組織中HSP27基因表達變化，結果表明，長期大劑量水楊酸鈉注射后大鼠耳蝸中HSP27基因表達明顯增強，達到3.16倍。我們前期的研究表明[5]，慢性水楊酸鈉作用后HSP27表達增強的主要部位為外毛細胞。HSP27表達增強可能是對外毛細胞進一步損傷的保護，防止應激后肌動蛋白微絲碎裂，穩定外毛細胞的細胞骨架[12]。水楊酸鈉是直接激活HSF1而啟動HSP27基因表達，還是在損傷過程激活HSF1其機制還有待進一步的研究。