中藥單體欖香烯體外對人晶狀體上皮細胞內膠原蛋白合成的影響
【摘要】目的：探討中藥單體欖香烯(effectsofe lemene,Ele)對人晶狀體上皮細胞系(humanlen sepithelialcellsB3,HLE B3)內Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白合成的影響。方法：利用10μg/L堿性成纖維細胞生長因子(recombinanthuman basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導HLE B3增殖，將80mg/L的Ele作用在處于增殖狀態下的HLE B3，24h后采用雙抗體夾心ABC 酶聯免疫吸附測定法(enzyme linkedimmuno sorbentassay,ELISA)檢測Ele作用后HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白表達。結果：rhbFGF作用后HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白濃度為53.5±5.4μg/L，較正常組(38.5±2.3μg/L)明顯升高，Ele作用后HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白的濃度為29.5±2.9μg/L，較rhbFGF組明顯下降(P<0.01)。rhbFGF作用后HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白濃度為1.27±0.29μg/L，較正常組(0.83±0.12μg/L)明顯升高，Ele作用后HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白的濃度為0.69±0.11μg/L，較rhbFGF組明顯下降(P<0.01)。結論：Ele抑制rhbFGF誘導的HLE B3增殖的同時也能抑制HLE B3內Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白合成，干擾HLE B3纖維化，可望成為防治后囊膜混濁的理想藥物。
【關鍵詞】欖香烯晶狀體;上皮細胞后囊膜混濁;Ⅰ型膠原蛋白;Ⅲ型膠原蛋白
引言
膠原蛋白(collagen)或稱膠原，是動物細胞合成的一種生物性高分子，是一類最主要的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)。目前的研究表明，ECM與后囊膜混濁的關系密切：ECM是構成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ，Ⅲ和IV型膠原;此外ECM還可調節細胞生長分化及細胞運動。欖香烯(elemene，Ele)是天然藥物莪術的主要成分，具有抗血栓形成、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡①②，我們的研究發現Ele能抑制由重組人堿性成纖維細胞生長因子(recombinant human basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導的人晶狀體上皮細胞系(humanlensepithelialcellsB3,HLE B3)增殖(另文報道)，我們進一步采用雙抗體夾心ABC酶聯免疫吸附測定法(enzyme linke dimmunosorbentassay，ELISA)檢測Ele作用后HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白(collagenI)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenIII)表達，探討Ele是否在抑制HLE B3增殖的同時還能抑制HLE B3內Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的合成，從而對阻止晶狀體上皮細胞纖維化起重要的作用。
1、材料和方法
1.1 材料
人晶狀體上皮人體神經元系HLE B3由西安中山社會眼科整形分析核心出具;Ele保濕乳，含量99.0%，威海金港醫藥較少子集團;rhbFGF為丹麥PeproTech子集團;DMEM養成基、胰核核血清酶和EDTA區別是美利堅Gibco子集團、美利堅Amresco子集團和美利堅Augus子集團;Ⅰ型膠原核核血清(collagenI)和Ⅲ型膠原核核血清(collagenIII)的ELISA制劑盒由北京西唐生物技術科技開發較少子集團出具。手動酶標讀數儀：美利堅BioTekELX808;錯位分析顯微鏡觀察：日式IMT 413;二防氧化碳養成箱：美利堅FORMA2111。存入導出凍存人體神經元的凍存管盡快放37℃泥中，將析出的人體神經元懸液用10倍容積以內的養成液對其進行稀釋液，離心法，除上清，總是洗滌劑3次。以5×10八個/L打疫苗于養成瓶中，37℃，50mL/LCO2養成箱養成。待人體神經元植物的生長相融后對其進行傳代養成。1.2 方法
80mg/LEle幫助24h后征集組織上清液;掏出都包被了抗人Ⅰ，Ⅲ型膠原球血清單克隆免疫抗原的96納米纖維板。設細則孔8孔，每孔各下載細則希釋液100mL，第四孔加細則品100μL，平滑后用加樣器吸出100μL，移至第2孔。如此這般一直稱兄道弟倍希釋至第7孔，后來從第7孔中吸出100μL棄去，使之占地均為100μL，第8孔為空白圖片組。待測品孔每孔各下載組織上清液100μL，每組6個孔;將影響板積極主動地混勻后置攝像頭37℃，120min;用洗滌液將影響板積極主動地洗滌5次，在過濾紙上印干;每孔加首免疫抗原操作液50μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加酶標免疫抗原操作液100μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加底物操作液100μL，置37℃暗處影響10min;每孔加50μL終結液混勻。在492nm處測吸光度值;依據細則品A值繪出細則身材曲線方程，依據合格品A值在該身材曲線方程圖上得知合理的Ⅰ型、Ⅲ型膠原球血清分量。 參數做好分析學做好分析：參數以均數±規范差(±s)覺得，主要包括SPSS12.0參數做好分析軟文做好參數外理。2、結果
rhbFGF組HLE B3內Ⅰ型膠原組織質的分量較空頁一片圖片處組清晰加大，與空頁一片圖片處組兩者左右差別具備匯總表學學現實意議(P<0.01;Ele組HLE B3內Ⅰ型膠原組織質的分量較rhbFGF組清晰下跌，與rhbFGF組兩者左右差別具備匯總表學學現實意議(P<0.01)。這說明怎么寫Ele能大大減少HLE B3內Ⅰ型膠原組織質的分量。rhbFGF組HLE B3內Ⅲ型膠原組織質的分量較空頁一片圖片處組清晰加大，與空頁一片圖片處組兩者左右差別具備匯總表學學現實意議(P<0.01);Ele組HLE B3內Ⅲ型膠原組織質的分量主要較rhbFGF組清晰下跌，與rhbFGF組兩者左右差別具備匯總表學學現實意議(P<0.01)。這說明怎么寫Ele能大大減少HLE B3內Ⅲ型膠原組織質的分量。Ele對HLE B3內Ⅰ，Ⅲ型膠原組織質的分量的危害3、討論
膠原蛋白或稱膠原，是動物細胞合成的一種生物性高分子，是ECM中最主要的一類物質。經過數十年來的研究和發展,業已發現并確認了膠原蛋白有25種類型，其中Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白約占膠原蛋白總量的80%～90%。膠原蛋白纖維化是許多疾病的病理表現之一，膠原蛋白分子的異常合成和沉積是纖維化反應的基礎。如彌漫性肺纖維化早期表現為肺泡炎，后期為彌漫性肺間質纖維化,主要是肺間質中成纖維細胞數及其產生的膠原蛋白和其他結締組織成分增多，肺泡壁遭破壞，特發性肺間質纖維化時，肺組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原增高，肺臟變硬，順應性減退③。有研究表明，高血壓左心室肥厚時不僅存在心肌肥大的變化，心肌間質纖維化亦是重要的病理改變，Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白的表達增強,促進了間質的纖維化④。ECM是構成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原，ECM可調節細胞生長分化及細胞運動。纖維粘連蛋白等ECM可促進某些黏附分子磷酸化，從而促進細胞移行。白內障摘除術后，殘留的晶狀體上皮細胞通過細胞膜上的黏附分子與細胞外基質及細胞內骨架蛋白相連，促使細胞移行并發生晶狀體后囊膜皺縮。Ishida等⑤研究發現：米諾地爾能抑制體外培養的晶狀體上皮細胞的增殖、移行及膠原分泌。張鳳妍等⑥探討表皮生長因子、白細胞介素1、干擾素和生長抑素8肽在晶狀體后囊膜混濁形成中的作用及影響膠原合成的機制，發現表皮生長因子、白細胞介素1參與晶狀體后囊膜混濁形成時的膠原合成，干擾素和生長抑素8肽的作用提示其可用于防治晶狀體后囊膜混濁。在本研究中，10μg/LrhbFGF作用后，HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白濃度為53.5±5.4μg/L，較正常組(38.5±2.3μg/L)明顯升高，說明rhbFGF能促進HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白的合成。經Ele作用后，HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白的濃度為29.5±2.9μg/L，較rhbFGF組明顯下降。結果提示，Ele能抑制HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白的合成。我們還發現，10μg/LrhbFGF作用后，HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白濃度為1.27±0.29μg/L，較正常組(0.83±0.12μg/L)明顯升高，說明rhbFGF能促進HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白的合成。經Ele作用后，HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白的濃度為0.69±0.11μg/L，較rhbFGF組明顯下降。本結果提示，Ele能抑制HLE B3內Ⅲ型膠原蛋白的合成。本結果提示，rhbFGF在促進HLE B3增殖的同時，也能促進HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的合成;Ele能有效抑制HLE B3內Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的合成。進一步說明作為ECM重要成分的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，是構成纖維化性混濁的重要原因，也是導致晶狀體后囊膜纖維化并發生混濁的重要機制。Ele有望成為防治后發性白內障的有效藥物。
【參考文獻】
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