口腔致病菌在生物膜狀態和浮游態中的特性比較
【摘要】在人類口腔中存在著種類繁多的天然菌群,這些細菌以牙菌斑生物膜的形式生長。菌斑生物膜作為人類齲病和牙周病的主要致病因素,有諸多代謝特點和生理現象明顯不同于浮游態的細菌。下面就數種主要的口腔致病菌在生物膜狀態和浮游態下的特性,如對抗菌劑的敏感性、基因表達和信號傳導、耐酸性等方面的研究進展作一綜述。
【關鍵詞】口腔致病菌;生物膜;浮游狀態
在自然界中,90%以上的微生物是以生物膜形式生存生長的,該結構通常為菌體在逆境條件下產生①。生物膜是一種由基質包裹的相互黏附或附著于體表或界面的微生物群體,而牙菌斑作為一種典型的細菌性生物膜,是研究最多的生物被膜之一,其中大約包含500種微生物,是人類感染性疾病如齲病和牙周病的主要致病因素②。
在牙菌斑中,日常細菌從浮游的生張狀況到成熟期的菌物膜,所涉更多菌物學優點的調整。下以數種具體口腔內致病性菌來說整合菌物膜的探討發展,對其在菌物膜狀況和浮游態下的具體優點作一文獻綜述。1、細菌對抗菌劑的敏感性
抗菌劑的使用是控制牙菌斑的一種重要手段。有不少學者用不同的檢測手段證實,生物膜中的細菌對抗菌劑的敏感性較處于浮游狀態時要低很多,而口腔細菌又常以生物膜的方式致病,對多數抗菌劑具有較強的抵抗力。生物膜對抗菌劑的耐藥性是一個多因素過程,主要跟生物膜結構和生理特征有關③。臨床上常規采用的體外藥物敏感檢測的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度值,用的是浮游態細菌,而非生物膜,這就造成了實驗室的藥敏結果與臨床療效之間存在差異。
生物膜對抗菌劑的敏感性大大降低與生物膜中的持留細胞(persistercell)有關系④。持留細胞被認為是一類數量極少并處于不生長狀態的細菌細胞,既存在于浮游狀態下,也存在于生物膜中,是菌群中大量正常細胞的不同表型⑤,不同劑量的抗菌劑作用于生物膜后,總會有少量的細胞能存活下來,其表型發生轉化并與親代正常細胞具有相同的性質,即為持留細胞。正因為持留細胞對抗菌劑的高耐受性和對生物膜的專有性,生物膜中的細菌較其在浮游態下對抗菌劑的耐受性大大提高。此外,許多治療因子在到達細菌之前與生物膜胞外多糖基質結合,其抗菌性失活。總之,上述研究強調了為什么口腔細菌的研究應該在生物膜上進行,而不應建立在浮游態細菌基礎上的緣由⑥。
1.1 細菌對氯己定的敏感性
氯己定(Chlorhexidine,CHX)作為一種口腔黏膜消毒劑,具有廣譜抗菌活性和強大的抑菌作用,其漱口水廣泛用于口腔感染。Wilson等⑦通過生物膜厚度發酵裝置來形成血鏈球菌生物膜和浮游態血鏈球菌,分別暴露于CHX和十六烷基銨基吡啶(cetylpyridiniumchloride,CPC),結果在生物膜中的血鏈球菌對CHX和CPC的敏感性較浮游態下的血鏈球菌更低。Decker等⑧以釉質和載玻片作為載體,在熒光顯微鏡下通過死菌和活菌計數計算活菌百分率來評價浮游態和生物膜血鏈球菌對CHX的敏感性。結果顯示,經過CHX對浮游態血鏈球菌的預處理后,黏附后活菌百分率的平均值分別為14%~18%(釉質)和24%~25%(載玻片);相反,未經CHX預處理的生物膜血鏈球菌平均活菌百分率分別為70%~75%(釉質)和68%(載玻片)。
1.2 細菌對麝香草酚的敏感性
麝香草酚作為口腔科常用制劑中的成分之一,具有抗菌性和抗真菌性等藥理特性。白假絲酵母菌具有潛在的毒力和致病性并能形成生物膜以抵制傳統的抗真菌劑,Braga等⑨通過白假絲酵母菌ATCC3153A和ATCCMYA2876的檢測發現,麝香草酚能干預白假絲酵母菌生物膜形成的初始階段和成熟階段生物膜的形成,在浮游態細胞最低抑菌濃度2倍的情況下,生物膜細菌的代謝活性僅僅降低了90%左右。可見生物膜作為一種多因素現象,麝香草酚的多種機制能影響其形成的不同階段。
1.3 細菌對地莫匹醇的敏感性
地莫匹醇可通過抑制口腔微生物黏附至牙面而影響牙菌斑生物膜的發展和成熟,在一定程度上還影響細菌的代謝從而預防和治療牙齦炎⑩。Burgemeister等⑾⑿通過熒光染色計算活菌數發現,在質量分數0.2%的地莫匹醇-氯化氫溶液中,血鏈球菌生物膜和浮游血鏈球菌的活菌數均顯著下降;而暴露于質量分數0.05%的地莫匹醇-氯化氫溶液中時,血鏈球菌生物膜細菌總數并未下降,浮游態血鏈球菌的活菌數則下降。即在生物膜形成的初始階段,地莫匹醇-氯化氫溶液在0.05%或是更高的質量分數下有殺菌作用,因而有較大的臨床應用前景。
1.4 可見光和過氧化氫的抗菌協作效應
Steinberg等⒀利用可見光和過氧化氫對浮游態變異鏈球菌的抗菌協作效應進行了證實性研究,在其研究中檢測到一種可見光和過氧化氫結合體對生物膜中變異鏈球菌的活力和基因表達的影響力。結果顯示,生物膜中的變異鏈球菌在濃度為3~300mol/L過氧化氫中暴露于波長400~500nm可見光下0.5或1min,抗菌效果通過對死菌或活菌計數,可見光和過氧化氫結合體在激光共聚焦掃描顯微鏡下對于生物膜每一層都有一種協同性的抗菌效果。此外,生物膜細菌在此種方法下較浮游態細菌更有效。綜上可見,可見光和過氧化氫結合體可作為最低限度的抗菌過程應用到生物膜相關疾病的防治中。
2、細菌的基因表達和信號傳導
在牙菌斑生物膜中,細菌在應對生物膜所處的復雜環境時將啟動一套完全不同的基因系統,有不同的基因表達形式。Maira-Litr?觃n等⒁發現,生物膜中的菌細胞會表達一些跟浮游細胞不同的表型。細菌在生物膜中并非以游離狀態存在,而為了適應周邊環境,可通過種間或種內的信號傳導通路來協調群體的行為⒂,使群體細菌表現出共同的生物學行為。
2.1 基因的轉錄分析
變異鏈球菌作為一種主要的口腔致病菌,常以生物膜的形式生活。Shemesh等⒃采用體外比較轉錄分析的方法來鑒定變異鏈球菌在生物膜狀態下和浮游狀態時的基因表達,其DNA序列分析顯示,大約12%的基因有顯著性差異表達;在相對于浮游狀態而言的生物膜狀態下,有139種基因被激活,104種基因被抑制,有20種被選擇基因的差異表達通過實時定量聚合酶鏈反應得以鑒定。該研究對變異鏈球菌生物膜生長過程中的基因表達提供了新的見解。
2.2 不同糖源下的轉移酶應答
菌斑生物膜所處的環境反過來會對細菌的基因表達產生影響。Shemesh等⒄采用實時定量聚合酶鏈反應,體外對比變異鏈球菌在生物膜狀態和浮游狀態下的相關基因對葡萄糖和蔗糖的應答。結果顯示,在相對于浮游狀態而言的生物膜狀態下,所有變異鏈球菌被檢基因在生物膜中起正調節作用。在他們所檢測基因中,做得最多的是對編碼葡糖基轉移酶(glucosyltransferase,gtf)和果糖基轉移酶(frucosyltransferase,ftf)基因的觀察。結果顯示,gtfBmRNA的誘導作用在生物膜形成中相對于浮游態是22倍,gtfCmRNA的增長作用在生物膜形成中相對于浮游態是14.8倍,ftfmRNA的誘導作用在生物膜中相對于浮游態是11.8倍。盡管在有蔗糖存在時生物膜相關基因表達中的正性調節有顯著意義,但是葡萄糖的加入會降低大部分基因的表達。由此可見,糖源的種類對生物膜狀態和浮游態下細菌gtf和ftf基因的表達起著重要的影響。
2.3 生物膜的抗血清反應
口腔血鏈球菌是牙菌斑生物膜中的先鋒菌,也是口腔正常菌群的優勢菌之一,與其相對的浮游生物細胞在表型上完全不同。Black等⒅通過對血鏈球菌生物膜和浮游生物細胞的表型分析證實,生長方式影響血鏈球菌的表面性質。血鏈球菌生物膜經過抗血清反應后,其生物膜細菌基因庫中顯示產生了32種基因重組克隆,表達了21種不同的血鏈球菌蛋白;另外,纖維黏附素CshA及其疏水性表達在血鏈球菌生物膜中明顯提高。在對所選用的大腸桿菌的不同分析中,其生物膜的抗血清反應有5次較浮游態細菌抗血清反應要強,即在生物膜細胞中,由cshA基因和cna基因編碼的表面膠原蛋白呈正性調節,然而在浮游態中則不然。
2.4 密度感應信號系統
密度感應信號(quorumsensingsignal,QS)系統對牙菌斑生物膜的形成具有重要作用⒆,可改變菌體生理特性并影響生物膜的結構穩定性。對鏈球菌QS系統的研究發現,QS系統可誘導細菌接受外源性DNA,如生活在生物膜中的變異鏈球菌較浮游態下的變異鏈球菌更容易接受外源DNA,而且變異鏈球菌的轉化頻率是其浮游態的10~600倍⒇。大多數細菌利用QS系統調控其特定的生理功能,而且不同于浮游態下的細菌生長特點。生物膜內細菌的生理特性由密度感應信號系統調控,進而影響生物膜的發展成熟⑥。
3、細菌的代謝特點
3.1 細菌的耐酸性
熟的生態學膜受損體組織系較在浮游情況下針對酸有更強的抵擋力。遺傳變種鏈球菌可在較低pH值大環鏡下促進出酸耐熱不良現象以增加其求野外生存力。Welin-Neilands等在使用死菌和活菌熒光染料的研究遺傳變種鏈球菌生態學膜的酸耐熱不良現象效果素質極其耐酸性膠泥性期間中顯示,區別的遺傳變種鏈球菌菌株生態學膜受損體組織系的酸耐熱不良現象效果素質是其此類浮游態下的820~7.0×104倍,較浮游受損體組織系有更強的耐酸性膠泥性。并且他倆還顯示,氟化物有抑止酸耐熱不良現象的促進特性,在pH3.5大環鏡下僅有77%的受損體組織系求野外生存率。可見,遺傳變種鏈球菌的區別菌株具備有區別的酸耐熱度和區別的促進酸耐熱不良現象的效果素質。3.2 細菌的抗饑餓性
與浮游態下的微怪物學比較較,怪物學膜中的微怪物學代謝率特殊性擁有較為復雜化性和較為廣泛性。Zhu等順利通過脈沖光共精準定位檢測高倍顯微鏡和免疫細胞熒光技巧測得察覺到,怪物學膜的感覺和浮游態中的遺傳變種鏈球菌時做24h無底物的饑餓處里后,遺傳變種鏈球菌在怪物學膜的感覺下較浮游態擁有更強的耐饑餓特性。4、結束語
主要是因為生物工程制品膜中的菌和病毒和病毒究竟是人類基因理解、分解分解代謝功用,最好某些的生物工程學表現都跟浮游態下的菌和病毒和病毒有很大的的差別的;因為,調查生物工程制品膜中菌和病毒和病毒的生物工程學分解分解代謝優勢特點,關于更深層次的驟清晰明確齲病和牙齒病的起病制度、防控的措施并且輔導監床上口服藥物均兼備更重要的監床上價值。【參考文獻】
[1]Costerton JW,Stewart PS,Greenberg EP. Science,1999,284(5418):1318-1322. [2]Paster BJ,Boches SK,Galvin JL,et al. J Bacteriol,2001,183(12):3770-3783. [3]Rodríguez-Martínez JM,Pascual A. Enferm Infecc Mi-crobiol Clin,2008,26(2):107-114. [4]Spoering AL,Lewis K. J Bacteriol,2001,183(23):6746-6751. [5]Balaban NQ,Merrin J,Chait R,et al. Science,2004,305(5690):1622-1625. [6]ten Cate JM. Odontology,2006,94(1):1-9. [7]Wilson M,Patel H,Fletcher J. Oral Microbiol Immunol,1996,11(3):188-192. [8]Decker EM,Weiger R,von Ohle C,et al. Clin Oral Investig,2003,7(2):98-102. [9]Braga PC,Culici M,Alfieri M,et al. Int J Antimicrob Agents,2008,31(5):472-477. [10]Baehni PC,Takeuchi Y. Oral Dis,2003,9(Suppl 1):23-29. [11]Addy M,Moran J,Newcombe RG. J Clin Periodontol,2007,34(1):58-65. [12]Burgemeister S,Decker EM,Weiger R,et al. Eur J Oral Sci,2001,109(6):425-427. [13]Steinberg D,Moreinos D,Featherstone J,et al. Antimicrob Agents Chemother,2008,52(7):2626-2631. [14]Maira-Litran T,Allison DG,Gilbert P. J Appl Microbiol,2000,88(2):243-247. [15]Paster BJ,Boches SK,Galvin JL,et al. J Bacteriol,2001,183(12):3770-3783. [16]Shemesh M,Tam A,Steinberg D. Microbiology,2007,153(Pt 5):1307-1317. [17]Shemesh M,Tam A,Steinberg D. J Med Microbiol,2007,6(Pt 11):1528-1535. [18]Black C,Allan I,Ford SK,et al. Arch Oral Biol,2004,49(4):295-304. [19]Li YH,Tang N,Aspiras MB,et al. J Bacteriol,2002,184(10):2699-2708. [20]Li YH,Hanna MN,Svensater G,et al. J Bacteriol,2001,183(23):6875-6884. [21]Chen X,Schauder S,Potier N,et al. Nature,2002,415(6871):545-549. [22]Welin-Neilands J,Svensater G. Appl Environ Microbiol,2007,73(17):5633-5638. [23]Zhu M,Takenaka S,Sato M,et al. Oral Microbiol Immunol,2001,16(1):24-27.