牙齦單胞菌誘導人白細胞脫顆粒的體外觀察

發布時間：2011/11/1 16:33:28

【摘要】目的：研究牙齦卟啉單胞菌及其可溶性毒力因子對人多形核白細胞的影響，探討其導致慢性牙周炎發生的作用機制。方法：采集健康中老年人外周血，利用透射電鏡觀察多形核白細胞培養組(對照組)與牙齦卟啉單胞菌超聲粉碎濾液共同培養組(實驗組)多形核白細胞脫顆粒現象。結果：實驗組多形核白細胞發生明顯的形態學變化，而對照組細胞無明顯變化;實驗組脫顆粒白細胞百分數較對照組顯著增多(P<0.001)。結論牙齦卟啉單胞菌可誘導多形核白細胞中顆粒向細胞周邊移動并脫出，從而降低宿主的免疫能力,在慢性牙周炎發生中具有重要作用。

【關鍵詞】牙齦卟啉單胞菌 多形核白細胞 細胞脫顆粒

慢性牙周炎在中老年人中的患病率極高，是導致中老年人群牙齒缺失的主要原因。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)是慢性牙周炎重要的可疑致病菌之一^①，可通過其可溶性產物對牙周組織造成損傷，而多形核白細胞(polymorphonuclearleukocytes，PMNLs)是機體抵抗病菌入侵的第一道防線^②。在牙周炎發病過程中，宿主自身抵抗力的差異性是一個重要的因素，PMNLs的功能正常與否，直接關系著機體免疫力的高低。研究發現：牙周致病菌與PMNLs的相互作用在牙周病的致病機制中起重要作用^③④。目前針對P.g可溶性毒力因子對PMNLs影響的系統研究較少，本研究旨在通過觀察P.g超聲濾液誘發PMNLs脫顆粒的形態變化，探討P.g可溶性毒力因子對PMNLs的影響。

1、材料與方法

1.1 細菌菌種與研究對象

P.g準則菌株ATCC33277(購自重慶市口腔里面臨床研發所)。選用10例營養老人由人檢測相親對象，情侶各5例，差不多年領(60±5)歲，一切受試者均知道征得。受試者的選用準則包擴：無下半身性的疾病;近3月無使用抗菌藥類中成藥;無游戲活動性齲，牙體營養。

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養及超聲濾液的制備

將P.g接種疫苗在血管瓊脂塑造細胞培訓液中(營養價值瓊脂加10%鮮美兔血)，10%CO2的活性污泥區域，37℃塑造培訓24h。將萌發不錯的大腸桿菌用生理上淡鹽水洗下，標準配置成2基層單位麥氏比濁管的質量溶度(6×108CFU/ml)，將該質量溶度的大腸桿菌置高周波儀中高周波磨碎(PG115型高周波破碎工藝儀，法國MSE集團公司)，取上清做好進行過濾，濾過液置4℃上傳緊急。

1.2.2 外周血PMNLs的分離培養

取10例身體老齡人人靜脈注射血20ml，肝素抗凝后，用不陸續體積密度均值Percoll分開PMNLs。先將70%鹽溶度Percoll水氫氧化鈉溶液慢慢地下載試管內，多加50%鹽溶度的Percoll水氫氧化鈉溶液，使之導致滿意率的對話框。加抗血凝(約1.5ml)后離心法25min，再次收取多形核受損體細胞膜層，將受損體細胞膜用不添加血清的教育鍛煉液清洗2次，用含10%胎牛血清的RPMI1640教育鍛煉液而成受損體細胞膜懸液(5×106/ml)，37℃，5%CO2孵箱中教育鍛煉24h。

1.2.3 細菌超聲濾液作用于PMNLs

隨機數包含兩對，研究組在PMNLs內加盟P.g超聲心動圖粉碎機濾液200μl，差表組的PMNLs內加盟RPMI1640提升液。在0、10、30和60min4個時段通過電鏡查看。

1.2.4 透射電鏡樣品的制備

將細胞懸液抽濾15min，形成細胞經2.5%戊二醛放置，1%鋨酸放置后，工業乙醇系類過濾，Epon812氯化橡膠漆聚酯樹脂包埋，超輕薄切成片后用冰醋酸雙氧及檸檬百香果鉛反向著色，散發出電鏡(JEM1200EX)看、攝片。

1.3 統計學分析 用SPSS11.5統計軟件進行數據分析。采用成組設計兩樣本均數比較t檢驗。

2、結果

2.1 P.g超聲濾液誘發PMNLs脫顆粒的形態變化

電鏡考察信息顯示：相較比較組中各用時點PMNLs價值形式完好篇，生殖組織細胞結構漿內無顯著粉末物劑，生殖組織細胞結構膜頂部井井有條，生殖組織細胞結構核呈分葉狀、可口(圖1A)。而實驗報告組中PMNLs在P.g超聲心動圖濾液的作用10min時，生殖組織細胞結構內有顯著的粉末物劑集中并向生殖組織細胞結構附進移動手機的原因(圖1B)，在30和60min時，PMNLs存在脫粉末物劑原因，同一有著生殖組織細胞結構不完好篇，生殖組織細胞結構膜不平滑細膩，生殖組織細胞結構核皺縮的原因(生殖組織細胞結構凋亡存在)，乃至存在生殖組織細胞結構裂解枯死。

2.2 脫顆粒的PMNLs與正常PMNLs百分數的比較

P.g的彩超濾液加如PMNLs后在0、10、30、60min4個時刻段點運用電鏡查看。數據信息顯示：在10、30和60min3個時刻段點轉化外出異，實驗性英文組在10min時脫粒子的PMNLs更多，在以后的時刻段里得出了將持續，而參考組下降較實驗性英文組穩定的。幾組脫粒子的PMNLs數

3、討論

老年人的牙周附著喪失重于年輕人，慢性牙周炎多見于中老年人。牙齦卟啉單胞菌是目前公認的牙周致病菌之一，也是牙周微生物領域重點研究的厭氧菌之一，與慢性牙周炎、侵襲性牙周炎、牙周膿腫和牙髓感染以及伴發性全身性系統疾病密切相關^⑤⑥。病原菌致病是一個多因素共同作用的過程，有參與基本生理過程的看家基因和多種毒力基因參與。P.g基因的多態性與復雜性使得其致病機制迄今尚不明了，已發現的P.g的毒力因子包括菌毛、牙齦素、脂多糖(LPS)等^⑦⑧。

PMNLs是機體免疫防御系統的重要組成部分，既是白細胞中功能最活躍的多功能細胞，也是參與炎癥反應的主要細胞。PMNLs具有吞噬作用，能夠在感染組織中遷移,預防炎癥的擴散，是細胞免疫和體液免疫的積極參與者，主要通過釋放多種蛋白水解酶而發揮殺菌功能^⑨。當PMNLs不能正常行使其功能時，細菌不僅不會被殺死，而且可以抑制溶酶體和吞噬體的融合。即便是PMNLs的吞噬能力正常，但對趨化性反應遲鈍，不能游走至趨化因子刺激的部位，會使感染經久不愈。PMNLs的殺菌作用主要依賴于吞噬溶酶體中顆粒成分所調節的非氧化機制。顆粒成分的細胞外釋放可能抵消PMNLs內殺傷作用，降低局部的免疫防御功能和屏障作用。導致溶酶體成分細胞外分泌的主動過程為細胞支架的聚合，它是顆粒向細胞周邊的轉運機制^⑨。此外，脫顆粒將導致牙周組織內溶酶體混合成分濃度的增加，它不僅有害于宿主細胞，而且還可以參與牙周組織的病理過程加劇炎癥反應^⑩。

將P.g用超聲波粉碎機粉碎，濾液內會含有該菌的絕大部分可溶性毒力因子。研究這種濾液既可以避免菌體本身的不確定性又能避免單一成分的不完整性，是一種方便、可靠的有效途徑^④。本實驗將P.g超聲粉碎濾液與健康中老年人外周血中的PMNLs共同培養,結果發現：實驗組(在PMNLs中加入P.g超聲粉碎濾液)和對照組(在含抗毒血清的PMNLs中加入P.g超聲粉碎濾液)存在顯著差異，實驗組脫粒的PMNLs百分數明顯高于對照組，同時隨時間的延長，脫顆粒現象更加明顯。

本研發覺得，P.g的超聲心動圖絞碎濾液才能使更健康中中年男性人外周血中的PMNLs突發脫顆粒，引發使用下降快穿之女主的免疫檢測職能性引發根尖周炎炎的突發、經濟發展。可以特別留意的是，口腔、牙齒科有的是個多種多樣微菌物定植的微生態經濟控制系統，所有微菌物之中彼此之間依存、彼此之間牽制，不可幼稚的用簡單致病性菌對公司的傷害來代表口腔、牙齒科微菌物群的用。最后，不一樣個體戶的PMNLs的內在會出現職能性的地域性別差異，有無會對研發結局造成地域性別差異，還必須在將來的事情中進幾步研發。

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